Esta investigación se realizó en el campo experimental del Instituto Nacional de Investigación y Fomento Agrícola y Pecuario (INIFAP, Culiacán), con coordenadas geográficas de 24˚37'49'' latitud Norte y 107˚26'17'' longitud Oeste, así como en el laboratorio del Centro de Ciencias de Sinaloa. Se seleccionó como parcela experimental un predio infestado fuertemente desde hace varios años por fusariosis vascular del garbanzo, en la cual se realizó un muestreo de suelo en forma al azar y un análisis de fertilidad del suelo, cuyas características se presentan en la Table 1, observándose que es un suelo de textura arcillosa, de pH neutro, sin problemas de sales y bajo contenido de materia orgánica, con capacidad de intercambio catiónico media, altas concentra- ciones de calcio y magnesio, contenido medio de potasio y niveles bajos de nitratos, fósforo y azufre. Las concentraciones de los nutrientes solubles e intercambiables son bajas a excepción del calcio y magnesio, cuya concentración es alta y adecuada respec- tivamente.

Se realizaron ensayos in vitro y en campo con seis microorganismos antagonistas

autóctonos del centro de Sinaloa, México; cuatro bacterias (T442, T3141, 751, 7A1) y dos hongos (HRG-050 y HRG-060) del cepario del Centro de Ciencias de Sinaloa, aislados previamente a partir de suelo rizosférico de plantas de garbanzo con síntomas de fusariosis. Para evaluar el antagonismo in vitro de estas cepas, se empleó una cepa de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris raza 5, principal agente de la fusariosis del garbanzo en esta zona, perteneciente a la colección del INIFAP, identificada molecularmente e ingresada al GeneBank como KJ000584-raza 5 [8] . Las cepas fueron activadas mediante la inoculación de cajas Petri con medio de cultivo a base de agar nutritivo (AN) y agar FLO (AF) para las bacterias por el método de asada gruesa; y las cepas fúngicas en medio papa dextrosa agar (PDA), por el método de porción y fueron incubados a 28˚C durante 48 h en el caso de las bacterias y por cinco días en los hongos, en una incubadora de mesa Thermo Scientific, Modelo BK6160.

En principio, las cepas fueron sometidas a una distinción morfológica colonial [27] , para ello se sembraron por medio de asada, en cajas Petri con medio de cultivo de AN y AF para las bacterias y en PDA las cepas fúngicas, siendo incubadas a 28˚C por 48 y 72 horas, respectivamente. En las cepas bacterianas se determinaron las características microscópicas, considerando tinción Gram y presencia de esporas mediante la técnica de Schaeffer-Fulton [28] ; para la identificación mediante su conducta bioquímica se empleó el sistema de diagnóstico API BioMérieux 50CHB V4.0 complementado con 20NE V7.0; para ello se hicieron inóculos con material biológico fresco, el cual fue suspendido en solución salina y con éllo se llenaron las galerías de los API, y fueron incubadas a 33˚C por 24 y 48 horas, observándose posteriormente los colores de las reacciones producidas; una vez obtenidos los perfiles, éstos fueron identificados utilizando la base de datos de BioMérieux, empleada en estos ensayos. Para la identi- ficación de las cepas fúngicas se tomaron en cuenta características morfológicas de sus estructuras macroscópicas (color de micelio, forma de micelio y crecimiento) y micro- scópicas (hifas, conidios, clamidospora), considerando las claves taxonómicas de Ains- worth [29] .

Se realizaron bioensayos in vitro para determinar el efecto antagónico de las cepas por medio de la técnica de cultivo dual [30] , en cajas Petri (90 x 15 mm) con medio de cultivo PDA (15 mL); un disco de 1.0 cm de diámetro del micelio del fitopatógeno, con previo crecimiento (6 días) en PDA debido a las diferencias en sus tasas de crecimiento, fue sembrado a un cm de la orilla de la placa y fueron incubados a 28 °C; tres días después se sembró por el método de asada gruesa al centro de la caja, cada uno de los antagonistas bacterianos [31] ; los antagonistas fúngicos fueron sembrados por el método de porción, al otro extremo de la caja, mediante discos del mismo diámetro que el patógeno, tomados de la parte con esporulación de la colonia del antagonista [31] . Además se contó con un testigo absoluto en caja Petri con medio PDA, se colocó a 1.0 cm del borde un disco de 5 mm de diámetro del micelio del patógeno. Se realizaron cuatro réplicas por cada cepa. Las placas se incubaron a 28˚C por 15 días. El crecimiento radial de las colonias de antagonistas y fitopatógeno se midió cada 24 h, realizando las observaciones hasta los diez de post-incubación. La capacidad antagónica por antibiosis de las cepas ensayadas fue evaluada a los siete días de post-inoculación, mediante el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR), empleando la fórmula propuesta por [32] , PICR = [(R1 − R2)/100]; donde, PICR fue el porcentaje de inhibición en el crecimiento del micelio del fitopatógeno; R1 fue el crecimiento de la colonia del patógeno-testigo; y R2 el crecimiento radial de la colonia del patógeno en confrontación en cultivo dual.

Matraces de 500 mL con medio nutritivo a base de caldo nutritivo y caldo soya triptocaseína para bacterias y PDA para los hongos fueron inoculados con cada cepa. Mediante un asa se tomó una muestra de cada antagonista, previamente activado y purificado, colocándose en los matraces con los medios correspondientes; una vez inoculados se pasaron a una incubadora a 28˚C con agitación 150 RPM, durante una semana, para obtener la biomasa que fue cosechada por medio de una centrifuga Sigma 3-18P (20 minutos a 3800 RPM), a temperatura ambiente. Las bacterias se cuantificaron por la técnica de diluciones seriadas en tubos con solución salina estéril al 0.85%, y por conteo de colonias en placa, empleando la escala de McFarland, con turbiedad igual al estándar 0.5 [33] , para obtener una suspensión con una concentración de 1 × 10⁸ UFC mL⁻¹. La concentración de esporas fúngicas se estimó utilizando una cámara de Neubauer, para una concentración de 1 × 10⁸ conidios mL⁻¹ [34] . Con este inóculo se impregnaron semillas de garbanzo para efectuar la prueba de germinación de semillas y para la siembra en el ensayo de campo.

Con cada cepa antagonista (T442, T3141, 751, 7A1, HRG-050 y HRG-060) fueron inoculadas 40 semillas de garbanzo, colocándose diez semillas por caja Petri, además se contó con un testigo absoluto, donde a las semillas sólo se les aplicó agua, por tanto fueron siete tratamientos conformados con cuatro repeticiones; la unidad experimental consistió en una caja Petri. Una vez inoculadas las semillas, se pusieron en cuarto oscuro a temperatura ambiente para observar la germinación.

El trabajo se llevó a cabo durante el ciclo 2013-2014, la siembra se efectuó en Diciembre de 2013, empleándose semillas de garbanzo variedad Blanco Sinaloa 92. Cada trata- miento se aplicó en seis surcos de ocho m de largo. La densidad de siembra fue de doce plantas por metro lineal a una distancia de 10 cm entre semillas, con una separación de 0.80 m entre surcos y una profundidad de siembra de 15 cm. Para la fertilización se aplicaron los siguientes productos: nitrato de potasio, nitrato de calcio, sulfato de magnesio, fosfato monopotásico en dosis de 10, 10, 4 y 2 kg∙ha⁻¹, respectivamente. Se aplicó un riego de auxilio a los 20 días después de la siembra.

Se establecieron en base a la inoculación de semillas de garbanzo con las cepas autó- ctonas T442, T3141, 7A1, 751, HRG-050 y HRG-060, un fungicida químico y el testigo. Se estableció un diseño experimental de bloques completos al azar, con ocho trata- mientos y seis bloques por tratamiento. En cada bloque se escogieron diez plantas para evaluar el efecto protector y estimulatorio del crecimiento de los tratamientos. Para determinar el efecto protector de los antagonistas se empleó escala subjetiva, con valores de 1 a 5 para evaluar las variables vigor de planta (donde 1 representaba 0% de vigor y 5 significaba 100% de vigor, considerando desarrollo y flacidez de la planta); marchitez de follaje y cáncer oscuro en raíz (donde 1 era el 0% de clorosis en el follaje y 0% de cáncer en raíz, y 5 era el 100% de follaje totalmente marchito y 100% de raíces con cáncer oscuro). Para determinar el efecto de la estimulación del crecimiento y rendimiento, las variables consideradas fueron: altura de planta (cm), empleando cinta metálica desde la base del tallo hasta la parte más alta de la planta; diámetro de tallo (mm) medido con vernier digital, a 1.0 cm de la base del tallo; verdor de plantas en unidades del medidor Spad-502, marca Spectrum Technologies, Inc.; peso fresco y peso seco de planta (g); rendimiento (g) planta⁻¹.

Todos los datos se sometieron a un Análisis de Varianza, después de comprobarse su normalidad y homogeneidad, y se aplicó la prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (P ≤ 0.05) en SAS Versión 1.3.

En la Table 2 se indica la descripción morfológica de las cepas, según el Manual de Bergey’s, Palleroni [35] . En base a las características presentadas, se pudo otorgar una previa distinción, para posteriormente aplicar las pruebas bioquímicas, Larrea et al. [36] ; las colonias de T442 y T3141 se ubicaron previamente dentro del género de Bacillus por su forma irregular, color crema y apariencia de los bordes, Sosa et al. [37] ; 7A1 y 751 se clasificaron como Pseudomonas, Palleroni [35] ; y las cepas fúngicas se identificaron dentro del género Trichoderma, Kirk and Ainsworth [29] .

Con la prueba de tinción de Gram se logró conocer que las cepas T442 y T3141 mostraron tinción violeta, indicando ser células Gram positivas, además presentaron forma bacilar y presencia de endosporas; 7AI y 751 presentaron tinción Gram negativa, con forma de bacilos ligeramente curvados y sin presencia de esporas, lo que a su vez permitió corroborar que corresponden a Bacillus y Pseudomonas, respectivamente, según el Manual de Bergey’s, Palleroni [35] ; resultados que son similares a los encon- trados por Larrea et al. [36] para determinar el género Bacillus, así como por Álvarez et al. [38] , quienes mediante esta prueba identificaron a los microorganismos empleados como Pseudomonas.

La caracterización bioquímica de las bacterias se presenta en la Table 3, en donde se

puede observar que las cepas de T3141 y T442 sólo difirieron en las pruebas con Galactoxa (GAL), N-Acetil Glucosamina (NAG) y Gentobiosa (GEN), siendo negativas para T3141 y positivas para T442. Mientras que en las cepas 751 y 7AI las diferencias se presentaron con las pruebas de Hidrólisis de la Gelatina (GEL), asimilación de Ácido Cáprico (CAP), Ácido Adípico (ADI), Citrato (CIT) y Ácido Fenil Acético (PAC); en la primera la reacción fue negativa para 7AI y positiva para 751, con las otras cuatro pruebas 7AI presentó reacciones positivas y las de 751 fueron negativas.

Los análisis de perfil bioquímico aportados por la base de datos APILAB del test API 50 CHB y API 20 NE, ayudan a caracterizar de manera fácil y rápida la fisiología de estas bacterias, Gacitúa et al. [39] , considerándose muy útiles para la identificación hasta el nivel de especie por su elevada precisión. Además de la observación de morfología y esporulación, la respuesta a la tinción de Gram permite ubicarlos dentro de su género, Sosa et al. [37] y Álvarez et al. [38] . Mediante el empleo de los sistemas API, los microorganismos pudieron ser ubicados con un alto porcentaje de identifi- cación (Table 4), aunque para la cepa T3141 dicho porcentaje fue bajo.

El análisis morfológico efectuado con el microscopio biológico mostró que estas cepas pertenecen al género Trichoderma sp., de acuerdo al Catálogo de Ainsworth [29] , encontrándose micelio septado, presencia de conidióforo hialino muy ramificado, fiálides individuales y en grupos, conidios ovoides, pequeños racimos terminales de color verde fuerte a verde olivo y clamidosporas intercalares típicas del género Trichoderma.

El efecto antagonista in vitro de los agentes biocontroladores del crecimiento micelial de F. oxysporum ciceris se muestran en la Table 5. La capacidad antagónica de las cepas ocurrió con diferencias significativas (P < 0.05), observándose la formación de tres grupos, el primero integrado por HRG-060 y HRG-050 con el mayor efecto inhibitorio (82.67% y 78.33%), respectivamente; el segundo integrado por T442 y 751, las cuales inhibieron al fitopatógeno en los respectivos 58.7% y 57.3%; y el tercero que formaron T3141 y 7AI, que inhibieron al patógeno en 34.7% y 33.3%, respectivamente.

%ID = porcentaje de identificación.

*Letras diferentes en la columna indican diferencias estadísticamente significativas, según Tukey (P < 0.05).

Tanto en los antagonistas fúngicos como bacterianos, los valores de inhibición del crecimiento del patógeno fueron variados, siendo unos altamente inhibitorios mientras que en otros fue limitada, sugiriendo que hay una variación entre el tipo de metabolitos antifúngicos producidos por las cepas, concordando con los resultados obtenidos por Eshetu et al. [16] y López et al. [40] .

Los resultados logrados con las cepas HRG-060 y HRG-050 (Trichoderma sp.) son muy semejantes a los obtenidos por Aponte et al. [41] con cepas ensayadas para el biocontrol in vitro de diferentes patógenos del suelo, incluido Fusarium; también coinciden con los de Ríos et al. [42] , quienes reportan inhibición de crecimiento de F. oxysporum en más del 50% con cepas nativas de Trichoderma (Figure 1). De las cepas bacterianas, la que ocasionó mayor PICR (58.7%) fue T442, identificada bioquími- camente como Bacillus subtilis, valor que de acuerdo con Gajbhiye et al. [43] es competitivo, ya que en su investigación aislaron e identificaron cepas de B. subtilis de la rizósfera de algodón y fueron probadas como agentes biocontrol de F. oxysporum, inhibiendo su micelio en más de un 50%.

Mediante diversas investigaciones se ha demostrado que con aplicaciones de Trichoderma y Bacillus subtilis se obtienen excelentes resultados de biocontrol contra diferentes enfermedades que afectan a diversos cultivos. Así, Moradi et al. [11] eva- luaron cepas nativas de Trichoderma y B. subtilis, las cuales suprimieron eficazmente la marchitez vascular del garbanzo causada por F. oxysporum ciceris. Asimismo, Kumar et al. [44] trabajaron con aislados de Trichoderma y Bacillus en confrontación con F. oxysporum lycoperscisi y reportaron que el porcentaje de inhibición del patógeno por Trichoderma osciló en 44.4% - 84.8%, y entre 45.1% - 63.4% al emplear aislados de

Bacillus. Los resultados de esta investigación también coinciden con los de Maciel et al. [45] , ya que reportaron que cepas nativas de Trichoderma spp. y B. subtilis fueron antagonistas contra F. sambucinum, señalando que esta acción fue más pronunciada cuando se utilizó Trichoderma spp., el cual inhibió en más de 60% a las colonias del fitopatógeno. Por su parte, López et al. [40] reportan que cepas de Trichoderma y Bacillus nativas del noroeste de México tuvieron efectividad antagónica in vitro para control de la pudrición texana.

El biocontrol con cepas de Trichoderma sp. quizás se deba a la producción de enzimas, como viridin, trichodermin, tricodermina, tricotoxina, celobiasas, quitinazas y el compuesto 6-pentyl-αpirona, que les otorga actividad antifúngica al penetrar y causar lisis del micelio de F. oxysporum, Martínez et al. [20] ; sin embargo, diversos investi- gadores señalan que la competencia por espacio y nutrientes es una de las principales formas de ejercer el biocontrol sobre los patógenos del suelo, Infante et al. [17] , Ezziyyani et al. [30] y Astorga et al. [46] , tal como se observa en la Figure 1. Por otra parte, el antagonismo ejercido por ciertas cepas de Bacillus es por medio de antibiosis, competencia por espacio y nutrientes e inducción de resistencia sistémica; además, producen algunas enzimas que degradan la pared celular y que están involucradas en la actividad antagonista contra fitopatógenos, así como la producción de compuestos orgánicos volátiles, fitoalexinas y sideróforos, Bhattacharyya and Jha [22] y Singh and Singh [23] .

Con excepción de HRG-050, por inoculación de semillas con cinco antagonistas se logró incrementar de manera significativa el vigor de planta con respecto al testigo (Table 6); los mayores efectos se observaron con HRG-060 (Trichoderma sp.), T442 (B. subtilis) y T3141 (B. megaterium), los cuales superaron al testigo en 76%, 61% y 50%, respectivamente, incluso en las plantas cultivadas con HRG-060 el vigor fue significa-

*Letras no comunes indican diferencias estadísticamente significativas según Tukey (P < 0.05).

tivamente mayor que el expresado por aquéllas tratadas con el producto Benomilo (testigo químico). En marchitez de follaje se observaron disminuciones significativas (28.7% y 23.9%) donde se aplicaron las cepas de HRG-060 y T442, respectivamente, en comparación al testigo. Mediante la inoculación de semillas con HRG-060, T442 y 7A1 el cáncer en raíz disminuyó en los respectivos 28.9%, 23.7% y 19.7% con respecto al testigo. Además, con HRG-060 (Trichoderma sp.) la disminución del cáncer fue 22.2% mayor que lo que se obtuvo con Benomilo.

Estos resultados coinciden con diversos trabajos realizados a nivel de campo, donde se aplicó a estos organismos como antagonistas, reportándose una reducción significa- tiva del cáncer en raíz, Karimi et al. [10] , Moradi et al. [11] , Manjunatha et al. [47] y Verma et al. [48] . De la misma manera, estos antagonistas han sido empleados en otros cultivos para protegerlos del ataque de fitopatógenos; al respecto, Arcos y Zúñiga [49] inocularon tubérculos de papa con cepas nativas de Bacillus, y lograron 60% menos de bulbos infectados con Rhizoctonia y Spongospora.

El efecto protector de las cepas nativas de HRG-060 (Trichoderma sp.) y T442 (B. subtilis), quizás se deba a la producción de metabolitos y enzimas que ha sido docu- mentada por diversos investigadores, como Qualhato et al. [50] que refieren que la mayoría de las especies de Trichoderma producen y secretan metabolitos tóxicos volá- tiles como β-1,3-glucanasa, quitinasa, fosfatasa ácida, celulasa y proteasas ácidas, que tienen efectos significativos sobre el crecimiento y desarrollo de los fitopatógenos, pues degradan su pared celular; asimismo, Tchameni et al. [51] que reportan que este género produce sideróforos que detienen el crecimiento de hongos patógenos; además se señala que la competencia por espacio y nutrientes, así como el micoparasitismo son sus principales mecanismos antagónicos, Ezziyyani et al. [30] . Otros investigadores afirman que el control biológico por Bacillus, es quizá por la producción de enzimas, metabolitos inhibitorios, antibióticos e inducción de la resistencia de la planta a los patógenos, Lima et al. [52] y Lee et al. [53] . Por su parte, Orberá et al. [54] reportan que esta bacteria es potencialmente antagónica a Fusarium sp. en cultivos ornamentales debido a la excreción de iturina, que actúa como antibiótico para fitopatógenos. Astorga et al. [46] demostraron que los procesos de competencia, antibiosis y parasitismo ejercidos por Trichoderma y Bacillus, lograron la inhibición y destrucción de Sclero- tium cepivorum, Penicillium sp. y Pseudomonas marginalis.

La germinación de semillas inoculadas con las cepas antagonistas (Table 7) tuvo su mayor expresión (125%, 125% y 100%) con las cepas T442 (B. subtilis), 751 (A. Radio- bacter) y HRG-060 (Trichoderma sp.) en comparación al testigo.

Estos resultados coinciden con lo reportado por Izzeddin y Medina [55] , quienes al inocular semillas de diferentes hortalizas con cepas de Trichoderma, Pseudomonas y Bacillus, observaron mayor germinación de las semillas tratadas con respecto al testigo; asimismo, con los de León et al. [56] , Chavarría y Carmona [57] , quienes reportan incrementos significativos en la tasa de emergencia de soya y melina al emplear estos

*Letras diferentes en la columna indican diferencias estadísticas significativas, Tukey (P < 0.05).

microorganismos como inoculo en las semillas. Por su parte, Shahid et al. [58] , aplicó Trichoderma en semillas de garbanzo y observaron germinación en más del 90% en laboratorio, superior en 15% al testigo. La estimulación en la germinación de semillas por estas cepas antagonistas puede atribuirse a la capacidad que tienen estos micro- organismos de producir sustancias fisiológica y bioquímicamente activas, como gibere- linas, citoquininas y ácido indolacético, las cuales estimulan la germinación de las semillas, Camelo et al. [59] y Sánchez et al. [60] .

En cuanto a la altura de las plantas (Table 8), las cultivadas con 7A1 fueron las de menor porte con 27.5% menos en comparación al testigo, mientras que las demás fueron estadísticamente iguales a éste. La misma tendencia se observó en el diámetro de tallo, aunque con HRG-060 se tuvo un incremento de 14.9 y con T442 de 8.5%. El verdor fue mayor con las cepas HRG-060, T442 y 7A1, con los respectivos incrementos de 12.8%, 11.7%, 12.6%, comparados con el testigo. El peso fresco y seco tuvieron incre- mentos de 56.8% y 29.0% con la cepa HRG-060, mientras que el rendimiento por planta se incrementó 155% y 72% con las respectivas cepas de HRG-060 y T442. Con HRG- 060 también se tuvieron incrementos de 74.3%, 42.8% y 481% más en peso fresco, peso seco y rendimiento de grano por planta, en comparación a los promedios obtenidos con el tratamiento químico (Benomilo).

Los resultados anteriores coinciden con los de Shahid et al. [58] y Yadav et al. [61] , ya que al inocular semillas de garbanzo con cepas de Trichoderma, reportaron incre- mentos significativos en altura y en peso seco de planta; asimismo, con los de Ávila et al. [9] y Verma et al. [48] , quienes reportaron incrementos del rendimiento de grano del garbanzo después de inocular semillas con el mismo hongo. Por su parte, Verma y Yavad [62] inocularon semillas de garbanzo con cepas de Bacillus y reportaron incre- mentos significativos en el peso seco de raíz, parte aérea de la planta, y número de granos; mientras que Arcos y Zúñiga [49] inocularon papas con cepas nativas de Bacillus subtilis y observaron incrementos en altura de plantas, materia seca y rendi- miento; De igual manera Jimtha et al. [63] notaron que Bacillus promueve notable- mente el crecimiento en plantas de jengibre.

*Letras diferentes en la columna indican diferencias estadísticas significativas, Tukey (P < 0.05).

El efecto estimulatorio en el crecimiento y rendimiento del garbanzo por parte de Trichoderma (HRG-060), quizás se deba a las hormonas que sintetiza (ácido indol-3- acético, auxinas, giberelinas y citoquininas), a la producción de sideróforos, solubiliza- ción de fosfatos y magnesio, eficiencia en el uso del nitrógeno, producción de ácido glucónico y ácido cítrico, aumento de la solubilización de micronutrientes (hierro y manganeso) o a la actividad antagonista contra F. oxysporum, tal como lo señalan numerosos investigadores [19] [48] [61] [64] . Por otra parte, la capacidad de estimula- ción del crecimiento por B. subtilis (T442), también puede ser consecuencia de las vitaminas que sintetiza, de la fijación del nitrógeno atmosférico y la solubilización de fosfatos que las plantas aprovechan [49] [59] [60] .