Os parâmetros cromatográficos em validação foram selecionados após testes preliminares. São eles:

i. Coluna: RP-18 5 um de 250 × 4.6 mm (Agilent Zorbax, Estados Unidos);

ii. Composição da fase móvel: 60% de CH₃CN + 40% de solução H₃PO₄ 0.1%;

iii. Eluição isocrática;

iv. Fluxo da fase móvel: 1.4 mL∙min⁻¹;

v. pH_{Solução da Fase Móvel/H3PO4}: 2.0;

vi. pH_{Fase Móvel/CH3CN + H3PO4}: 2.7;

v. Volume de injeção: 20.0 μL (volume da alça do injetor);

vi. Comprimento de onda do detector UV: 235 nm;

vii. Tempo de análise: 4 min.

A partir do padrão analítico do herbicida etilclorimuron (sólido) preparou-se um volume de 100.0 mL de uma solução estoque com concentração de 100.0 mg∙L⁻¹ em acetonitrila (Tedia, Brasil).

A partir desta solução estoque foram preparadas duas soluções iniciais com volume de 10.0 mL e concentrações de 10.0 mg∙L⁻¹ (solução S_i) e 1.0 mg∙L⁻¹ (solução S_ii).

Os ensaios de seletividade foram avaliados por meio da comparação dos resultados obtidos em amostras isentas da substância de interesse (etilclorimuron) e dos sedimentos adicionados do analito.

Os ensaios para análise da seletividade foram realizados em duas etapas. Na primeira, o herbicida etilclorimuron (solução inicial S_ii) foi determinado por HPLC-UV seguindo os parâmetros cromatográficos em validação. Na segunda etapa, repetiu-se o mesmo procedimento na análise dos sedimentos extraídos em acetonitrila.

Para obtenção do extrato dos sedimentos, adicionou-se 1 g de sedimento em 10 mL de acetonitrila. O conteúdo foi mantido sob agitação orbital durante 30 minutos e, em seguida, a matriz foi isolada e a solução purificada em filtro de seringa de celulose regenerada (Sartoriuns Stedim, Alemanha).

A linearidade foi determinada pela curva analítica, igual a. Para construção da curva prepararam-se 10 soluções com diferentes concentrações: 0.1; 0.5; 1.0; 5.0; 50.0; 100.0; 250.0; 500.0; 750.0 e 1000.0 μg∙L⁻¹ [10] [11] .

A faixa de trabalho compreendeu o intervalo entre a menor e a maior concentração determinada pelo método via análise da linearidade.

As faixas lineares foram os intervalos contidos na faixa de trabalho que corresponderam a uma tendência linear única, além de apresentar parâmetros lineares melhores que os da curva analítica atribuída a faixa de trabalho. Ou seja, são adotadas as faixas lineares se estas apresentam curvas analíticas com valores mais adequados de r, LOD e LOQ para o método analítico, se comparados aos mesmos parâmetros para a faixa de trabalho.

Os limites de detecção e quantificação (LOD e LOQ) foram calculados a partir dos parâmetros lineares da curva analítica. Para isso, utilizaram-se as seguintes equações:

em que: S_a é o desvio-padrão de a (coeficiente angular) e b é o intercepto (coeficiente linear) [10] [11] .

A sensibilidade do método foi determinada utilizando a equação da reta obtida para a faixa de trabalho e, caso ocorra, para as faixas lineares.

Segundo orientação do INMETRO, a sensibilidade é obtida pelo coeficiente angular da curva analítica (termo a da equação da reta) [10] .

Os ensaios para recuperação foram realizados de acordo com as orientações do INMETRO. A metodologia utilizada na determinação da recuperação é a mesma descrita pela ANVISA para determinação da exatidão. Segundo o INMETRO, a exatidão deve ser avaliada numericamente por meio da recuperação.

Para verificar a recuperação/exatidão foram adicionados 10.0 mL de solução do herbicida em 1.0 g de sedimento. Foram realizados ensaios com amostras fortificadas, seguindo as recomendações da ANVISA, avaliando 3 concentrações (baixa, média e alta) com 3 réplicas cada. As concentrações do herbicida analisadas foram: 10.0, 100.0 e 1000.0 μg∙L⁻¹.

Por meio das áreas obtidas, calculou-se a recuperação/exatidão do método:

em que: R(%) é o percentual de recuperação, A_f é a área do pico cromatográfico da amostra fortificada, A_n é a área do pico cromatográfico da amostra não fortificada e A_p é a área do pico cromatográfico do padrão analítico [10] [11] .

A precisão foi analisada com base nos resultados obtidos na análise da recuperação do método. De acordo com o INMETRO e a ANVISA, a precisão deve ser avaliada pelo coeficiente de variação (CV), calculado pela equação abaixo apresentada.

em que: CV é o coeficiente de variação, M_A é a média das áreas dos picos cromatográficos obtidos e S_A é o seu respectivo desvio-padrão [10] [11] .

Conforme orientado pelo INMETRO, a robustez do método foi determinada via teste estatístico de Youden. Os parâmetros analisados são referentes à fase móvel e foram aqueles recomendados pela ANVISA, a saber:

i. pH: 2.0 e 2.2;

ii. Composição: 60 e 58% de acetonitrile;

iii. Fluxo: 1.4 e 1.2 mL∙min⁻¹;

O pH foi ajustado utilizando ácido fosfórico (H₃PO₄) 85% (Qhemis, Brasil).Nas combinações ensaiadas para resolução do teste de Youden (Table 1), os valores utilizados na validação do método receberam uma letra maiúscula como código de identificação (A, B e C). Os valores referentes às pequenas variações receberam como código uma letra minúscula (a, b e c). Cada combinação (numerada de 1 a 8) recebeu uma letra para identificação dos resultados (de s a z).

O teste de Youden permitiu analisar o efeito de cada parâmetro, isoladamente, na robustez do método. Nas equações abaixo são apresentados os cálculos pertinentes. Os cálculos para o efeito do pH, da composição da fase móvel e do fluxo da fase móvel na robustez do método foram realizados de acordo com as seguintes equações:

em que: A/a, B/b e C/c são os efeitos do pH, da composição da fase móvel e do fluxo da fase móvel, respectivamente, na robustez do método. As letras de s a z identificam os resultados obtidos em cada ensaio [10] [11] .

Os ensaios para obtenção da seletividade do método iniciaram-se com o registro do espectro na região do ultravioleta-visível (Figure 3). O comprimento de onda de 235 nm foi o que apresentou maior absorção da radiação, logo este valor foi utilizado na calibração do detector UV do cromatógrafo.

Analisou-se a presença de picos cromatográficos com tempos iguais nos cromatogramas do padrão analítico (herbicida etilclorimuron) (Figure 4) e dos três sedimentos em análise (Figure 5). Observando os resultados obtidos, a retenção do analito deu-se até os 2.91 minutos da determinação cromatográfica. É possível observar que, no tempo de retenção do analito de interesse, não foram detectados outros picos cromatográficos com tempos de retenção coincidentes entre a matriz e o herbicida etilclorimuron. A composição dos sedimentos não apresentou influência na seletividade do método. O fluxo elevado (1.4 mL∙min⁻¹) juntamente com a alta polaridade da fase móvel permitiu a aglomeração dos picos cromatográficos referentes à matriz analítica nos primeiros instantes da separação cromatográfica, permitindo a detecção do herbicida sem interferentes. Assim, garante-se a seletividade do método [7] .

Para determinação da linearidade, utilizaram-se soluções do herbicida com concentrações variando de 0.1 a 1000.0 μg∙L⁻¹. Os picos cromatográficos só foram obtidos e quantificados a partir de 5.0 μg∙L⁻¹. Neste sentido, a faixa de trabalho atendida pelo método abrangeu o intervalo entre 5.0 e 1000.0 μg∙L⁻¹.

Table 3 apresenta as curvas analíticas e seus parâmetros lineares para a faixa de trabalho (FL_i) e duas faixas lineares (FL_iiA e FL_iiB) (Table 3).

A faixa de trabalho (FL_i) correspondeu ao intervalo entre a menor concentração determinada pelo método e a maior analisada (5.0 a 1000.0 μg∙L⁻¹). A primeira faixa linear atendeu ao intervalo de 5.0 a 250.0 μg∙L⁻¹ (FL_iiA) e a segunda faixa de 250.0 a 1000.0 μg∙L⁻¹ (FL_iiB).

Em função dos valores mais adequados de r, LOD e LOQ, optou-se por trabalhar com duas faixas lineares. A escolha da equação da reta para os cálculo da concentração deu-se pela área do pico cromatográfico. Picos com área de até 20,324.33 foramtratadas por meio da equação da reta da faixa linear FL_iiA. Acima deste valor deve-se a equação da reta referente à faixa linear FL_iiB.

Não foram calculados os valores de sensibilidade, LOD e LOQ para a faixa linear FL_iiB pois as concentrações analisadas não se encontram no limite inferior da curva analítica, aos quais estes parâmetros são inerentes.

Analisando os coeficientes de correlação linear (r), todos os resultados estão de acordo com os valores orientados. Um coeficiente de correlação maior que 0.999 é considerado uma evidência de um ajuste ideal dos dados para uma regressão linear. Para a ANVISA, a correlação mínima aceitável deve ser igual ou superior a 0.99. Para o INMETRO esse valor é de 0.9 [10] [11] .

Analisando o coeficiente de variação angular (valor de a da curva analítica) das retas obtidas (Table 3), a faixa linear FL_iiA é a que apresenta uma maior sensibilidade. Comparando com a faixa linear FL_i, este valor é bastante significativo. A diferença na sensibilidade entre estas duas faixas lineares é de aproximadamente 41.74%. O INMETRO não orienta um valor para a sensibilidade do método.

Considerando ser relevante uma sensibilidade alta para as concentrações baixas (mais difíceis de serem detectadas) é justificável a utilização de duas faixas lineares ao invés de apenas uma.

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram determinados via curva analítica, considerando as duas faixas lineares. Analisando os valores obtidos (Table 3), os valores de LOD e LOQ são significativamente inferiores quando a faixa de trabalho é dividida em duas faixas lineares.

O valor do LOD da faixa FL_iiA é aproximadamente 575% menor que aquele limite em FL_i. Para o LOQ esta diferença é de 517%. Esta considerável diferença é mais uma evidência para a utilização de duas faixas lineares. Nestas análises, a faixa linear FL_iiB foi desconsiderada por não contemplar as concentrações mais baixas distribuídas ao longo da faixa de trabalho.

Os documentos do INMETRO e da ANVISA não contemplam um valor a se validar para estes parâmetros. Tratando-se de pesticidas ou outras moléculas com ação danosa ao homem ou ao meio ambiente, são as agências e autarquias públicas de regulamentação ambientais que determinam estes parâmetros como Valor Máximo Permitido (VMP), e cabe aos métodos analíticos validarem seus LOD e LOQ atendendo a esta exigência, normalmente imposta por órgãos e autarquias ambientais. No caso do etilclorimuron, não existem VMPs associado a este herbicida.

Os ensaios de recuperação foram realizados a fim de contemplar a recomendação do INMETRO. Os valores obtidos (Table 4) indicaram que, quanto maior a concentração analítica analisada, menor foi o efeito da matriz. Isso fez com que a recuperação fosse maior nos ensaios com concentrações elevadas.

Considerando que a recuperação é um ensaio quantitativo, a concentração analítica de 10.0 μg∙L⁻¹ encontra-se abaixo do LOQ (29.48 μg∙L⁻¹), logo se justifica a dificuldade do método em obter um percentual de recuperação considerável, próximo a 100%.

Comparando os percentuais de recuperação obtidos e seus respectivos erros absolutos, houve diferença significativa apenas ao comparar as concentrações analíticas analisadas em 1000.0 e 100.0 μg∙L⁻¹ na amostra Zona Agrícola (aproximadamente 72% de diferença). Nas demais amostras analisadas, tais comparações não excederam 20% de diferença. Esta diferença pode estar sendo influenciada pela composição química dos sedimentos. O INMETRO não contempla um valor orientativo para os ensaios de recuperação.

Mesmo possuindo composições diferentes, os sedimentos influenciaram pouco na recuperação. Como o tempo de contato foi de 30 minutos, possivelmente não ocorreram processos sortivos ou de degradação significativos, a ponto de interferir nos resultados.

De acordo com a ANVISA, um método é considerado exato se este possuir uma recuperação entre 80 e 120% da concentração analítica inicial. O método proposto atendeu à esta consideração em quase todas as situações (Table 5). Os valores obtidos para a concentração de 10.0 μg∙L⁻¹ não foram validados pois apresentaram valores abaixo de 80%, valor mínimo aceitável. Além disso, a concentração de 10.0 μg∙L⁻¹ está abaixo do limite de quantificação, justificando a dificuldade do método em quantificar o analito nestas condições.

A amostra Zona Agrícola, na concentração de 1000.0 μg∙L⁻¹, apresentou uma recuperação de 133.33%, aproximadamente 13% acima do permitido. A dificuldade do método em recuperar a concentração exata pode- estar relacionada a superdosagem do herbicida etilclorimuron, a qual pode causar uma pertubação no sistema e detecção cromatográfica.

A precisão foi calculada a partir dos resultados obtidos na recuperação do método (Table 4), por meio do cálculo do coeficiente de variação. De acordo com as recomendações da ANVISA, não são admitidos coeficientes de variação acima de 15%. Para o INMETRO, os coeficientes de variação máximos permitidos são dados em função de cada concentração analisada. Para as concentrações de 1000.0, 100.0 e 10.0 μg∙L⁻¹ estes valores são 16, 23 e 32%, respectivamente. Assim, os valores obtidos foram validados de acordo com as recomendações da ANVISA e do INMETRO, para todas as amostras de sedimentos e em todas as concentrações estudadas.

A robustez do método foi analisada aplicando pequenas alterações nos parâmetros cromatográficos em validação. Estas variações implicaram em alterações nas áreas dos picos cromatográficos e no tempo de retenção do herbicida etilclorimuron. Devido à relação linear que existe entre as áreas dos picos e a concentração analítica, a concentração inicial (100.0 μg∙L⁻¹) foi quantificada com diferentes valores.

Analisando os resultados obtidos (Table 5), a diminuição no fluxo da fase móvel causou um acréscimo de aproximadamente 1 minuto em quase todos os ensaios. O aumento no tempo de retenção foi ainda mais significativo nas combinações em que ocorreu a diminuição no percentual de solvente na fase móvel. Possivelmente o aumento do percentual da solução (H₂O + H₃PO₄ 0.1%) na composição da fase móvel aumentou a interação entre o analito e a fase estacionária da coluna cromatográfica, aumentando a solubilidade do analito no leito da coluna cromatográfica, fazendo com que este ficasse retido por mais tempo [7] .

As variações de pH interferiram com menor intensidade na detecção do herbicida, possivelmente relacionado à sua alta solubilidade em solvente orgânico.

Aos valores apresentados na Table 5 aplicou-se o teste de Youden para o cálculo da robustez. O método mostrou-se mais robusto para as pequenas variações do pH da solução que compõem a fase móvel (A/a = 0.92), alterando irrisoriamente os resultados, seguido pelo fluxo (C/c = 7.20) e, por último, a composição da fase móvel (B/b = 14.86).